分光光度法 50 管/48 樣
測(cè)定意義：
Pro 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，逆境條件下，植物體內(nèi) Pro 含量顯著增 加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此， 脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標(biāo)之一。
測(cè)定原理：
用磺基水楊酸（SA）提取 Pro，加熱處理后，Pro 與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色；加甲苯 萃取后，在 520nm 測(cè)定吸光度。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、冰乙酸 50mL、 甲苯 50mL、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：冰乙酸 25 mL×1 瓶， 4℃保存。（自備） 試劑二：液體 25 mL×1 瓶， 4℃保存。
試劑三：甲苯 50mL×1 瓶，4℃保存。（自備）
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備： 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；之后 置沸水浴振蕩提取 10min；10000g，常溫離心 10min，取上清，冷卻后待測(cè)。 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加 入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿；之后置沸水浴振蕩提取 10min；10000g，常溫離心 10min， 取上清，冷卻后待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建 議取 0.1mL 血清（漿）加入 1mL 提取液），充分混勻，之后置沸水浴振蕩提取 10 分鐘，10000g， 常溫離心 10 分鐘，取上清，冷卻后待測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 520nm，蒸餾水調(diào)零。 2、樣本測(cè)定：
(1)取 0.5mL 樣本+0.5mL 試劑一+0.5mL 試劑二于有蓋試管中，置沸水浴中保溫 30min（蓋
緊，防止水分散失），每 10min 振蕩一次。
(2)待冷卻后，在試管中加入 1mL 試劑三，振蕩 30s，靜置片刻，使色素轉(zhuǎn)至試劑三中；吸 取 0.8mL-1mL 上層溶液于 1mL 玻璃比色皿中，于 520nm 波長(zhǎng)處比色，記錄吸光值 A。
Pro 含量計(jì)算：
1、典型回歸方程 y = 0.0521x - 0.0021 (x 為脯氨酸含量，μg/mL；y 為吸光值 A) 2、按照血清（漿）體積計(jì)算
Pro 含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021) 3、按照蛋白濃度計(jì)算
Pro 含(μg/mgprot)=[(A+0.0021)÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr 4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算
Pro 含量(µg/g 重)=[(A+0.0021)÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021)÷W 5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
Pro 含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021) V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.5mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿） 體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。
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