小牛胸腺DNA的制備——濃鹽法
目的要求
了解從動物組織中提取基因組DNA的方法。
實驗原理
DNA在生物體內(nèi)是以與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的，因此提取出脫氧核糖核酸蛋白復(fù)合物（DNP）后，必須將其中的蛋白質(zhì)除去。小牛胸腺，魚類精子和植物種子的胚等含有豐富的DNA，可作為提取DNA的良好材料。動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白可溶于水或濃鹽溶液，但在0.14mol/L鹽溶液中的溶解度很低，而核糖核蛋白則溶于0.14mol/L鹽溶液中，利用這一性質(zhì)可將脫氧核糖核蛋白與核糖核蛋白以及其他雜質(zhì)分開，當(dāng)核蛋白與氯仿一起振蕩時，蛋白質(zhì)變性而與核酸分開，核酸繼續(xù)保留于水相中，再用乙醇將水相中的DNA沉淀出來。
為除去DNA制品混雜的RNA，可用核糖核酸酶處理。大部分多糖在用乙醇或異丙醇分級沉淀時即被除去，如需要還可以進一步通過柱層析或電泳加以純化。
試劑和器材
1）、試劑
0.1mol/L氯化鈉—0.05mol/L、pH7.0檸檬酸鈉緩沖液；先配制0.05mol/L，pH—7.0檸檬酸鈉緩沖液，然后將氯化鈉溶于此緩沖溶液中，使其最終濃度達到0.1mol/L。
10%氯化鈉溶液；氯仿異戊醇混合液；95%乙醇，無水乙醇。
2）、材料
小牛胸腺
3）、器材
組織搗碎機、離心機、玻璃勻漿器。
操作方法
1、取新鮮的小牛胸腺，除去血水和結(jié)締組織，在水浴上切成小塊，稱取20g，加入2倍體積的0.1mol/L氯化鈉—0.05mol/L，pH=7.0檸檬酸鈉緩沖溶液，于組織搗碎機上高速勻漿5min。
2、組織糜用轉(zhuǎn)速為3000r/min的離心機離心15min，將沉淀用50mL上述緩沖溶液洗滌2次，洗滌時用勻漿器研磨洗滌，每次如前離心。
3、向最后得到的細胞核沉淀中加入6倍體積的10%氯化鈉溶液，充分?jǐn)噭蛑帽渲羞^夜，以充分提取DNP，溶液為黏稠狀。
4、將所得的半透明黏稠狀液體，用滴管慢慢注入冷蒸餾水中，邊加邊輕輕攪動，這時有白色絲狀物——核蛋白析出，在冰箱中靜置數(shù)小時，收集沉淀。將沉淀物再溶于4倍體積的10%氯化鈉溶液中，迅速攪拌以加速溶解。
5、加入1/2體積的氯仿異戊醇混合液，劇烈振蕩5min左右，用轉(zhuǎn)速為3000r/min的離心機離心15min，得三層：上層為含有DNA和DNA核蛋白的水層，下層為氯仿異戊醇的有機溶劑層，變性蛋白質(zhì)介于兩層之間。
6、吸出上面的水層，再用氯仿異戊醇如前進行脫蛋白，直至界面處不再出現(xiàn)變性蛋白質(zhì)為止。
7、最后吸出上清液并將其注入兩倍體積的95%乙醇中，用玻璃棒攪起白色纖維狀DNA沉淀，瀝干，用80%乙醇洗滌，最后用少量無水乙醇洗滌。盡量瀝干乙醇后，鋪開在表面皿上。置于真空干燥器內(nèi)干燥，既得白色纖維DNA鈉鹽。
注意事項
（1）、由于DNA主要存在于細胞核中，為了便于提取DNA，應(yīng)嚴(yán)格控制胸腺破碎的條件，既要將細胞膜破碎，又要盡可能避免細胞核被破壞，導(dǎo)致DNA釋放而被斷裂。
（2）、在用氯仿異戊醇除去組織蛋白時，要劇烈振蕩使蛋白變性。若振蕩不夠，蛋白質(zhì)不能很好除去，則影響DNA制品的質(zhì)量。
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