氨基比林-N-脫甲基酶 AND試劑盒說(shuō)明書
測(cè)定意義
細(xì)胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員，相當(dāng)于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。
測(cè)定原理
AND催化氨基比林釋放甲醛，通過(guò)Nash比色法測(cè)定甲醛含量，即可計(jì)算出AND活性。
自備儀器和用品
可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器槍、1mL玻璃比色皿、蒸餾水、無(wú)水乙醇和冰。
試劑組成和配置
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶（棕色瓶），4℃保存。臨用前加入2.6mL無(wú)水乙醇，充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.6mL蒸餾水，充分溶解。
試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水10mL充分溶解。
試劑六：液體×1瓶，室溫保存。
試劑七：液體×1瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5mL EP管，加入10ul標(biāo)準(zhǔn)液，加990ul蒸餾水，混勻即為0.05mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提取
1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。
2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分振蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分振蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。
AND活性測(cè)定操作：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min以上。
3、空白管：取1支EP管，加入50uL粗酶液，850uL試劑二，50uL試劑三，50uL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175uL。試劑五，混勻后置于水浴中5min：取出后加入175uL。試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min：取新的EP管，加入500uL上清液，500uL。試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A空白管。每個(gè)樣品都需要做空白管。
4. 測(cè)定管： 取 1 支 EP 管 加入 50µL 粗酶液 850µL 試劑50µL 試劑50µL 試劑四
混勻后置于 37℃水浴保溫 30min 立 加入 175µL 試劑五 混勻后置于冰浴中 5min 取出后加入 175µL 試劑混勻后室溫靜置 5min 室溫 8000rpm 離心 5min 取 1 支新 EP 管
加入 500µL 清液 500µL 試劑七 混勻后 60℃水浴 10min 然后取出 用冷水冷 5min
于 412nm 測(cè)定光吸收 記為 A 測(cè)定管
5.標(biāo)準(zhǔn)管 取 1 支 EP 管 加入 500µL 標(biāo)準(zhǔn)品 500µL 試劑七 混勻后 60℃水浴 10min
然后取出用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
AND活性計(jì)算
（1）、按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位（U）定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1umol甲醛。
AND活性（U/mg prot）=C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T=0.045×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr。
（2）、按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位（U）定義：37℃中每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1umol甲醛。
AND活性（U/g）=C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V樣）÷T=0.045×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W
C標(biāo)準(zhǔn)品：0.05mmol/L=50umol/L：V標(biāo)準(zhǔn)品：500uL=0.0005L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7：Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度mg/mL，需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒：V樣：加入粗酶液體積，50uL=0.05mL：W：樣本質(zhì)量，g：T：反應(yīng)時(shí)間，30min。
注意事項(xiàng)：
1、粗酶液需在當(dāng)日完成測(cè)定，如需保存，則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml20%的甘油。分裝后，-80℃保存。
2、試劑三和試劑四需臨用前配制，如當(dāng)天沒(méi)有用完，4℃避光保存，可用1周。
3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測(cè)定，建議用BCA法測(cè)蛋白含量。
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